1. Khảo sát phết máu ngoại vi:
· Kéo một lame máu. Đặc điểm của lam máu ngoại biên đạt tiêu chuẩn
− Chiều dài phết máu từ 2/3 đến 3/4 chiều dài của lam.
− Hình dáng phết máu giống hình ngón tay (hoặc còn gọi là hình lưỡi mèo), có vòng tròn rất mảnh ở vùng đuôi lam.
− Các cạnh bên của phết máu có thể thấy được.
− Phết máu mịn, không có lỗ hổng, bất thường hoặc vệt.
− Khi để lam dưới ánh sáng, phần đuôi lam sẽ thấy biểu hiện “cầu vồng”
− Phết máu sau khi được thực hiện cần phải để khô hẳn càng nhanh càng tốt trước khi nhuộm lam.
Hình 1. Lam máu phết đạt chuẩn
· Đợi tiêu bản khô đem nhuộm Giemsa theo quy trình.
· Quan sát đại thể: màu sắc lam nhuộm. Thông thường là lam phết máu ngoại biên có màu hồng. Màu phết máu màu xanh hơn bình thường có thể gợi ý tình trạng tăng protein trong máu bệnh nhân, như đa u tủy hoặc trong các trường hợp tăng bạch cầu trong bệnh bạch cầu cấp. Bề mặt gồ ghề trên phết máu có thể là tình trạng hồng cầu ngưng kết, như trong bệnh ngưng kết lạnh. Ngoài ra, có thể có những lỗ hỏng trên phết lam có thể gợi ý tình trạng tăng lipid máu.
· Quan sát dưới kính hiển vi: (1) hình thái hồng cầu (HC): độ phân bố, kích thước, hình dạng, màu sắc; (2) tiểu cầu (TC): số lượng, độ ngưng tập, hình thái; (3) bạch cầu (BC): số lượng, thành phần bách phân các loại BC, có tế bào bạch cầu bất thường không.
· Dùng vật kính x10 quan sát tổng thể làn máu, màu sắc, độ phân bố của tế bào trên lam. Mép lam và vùng đuôi lam nên được kiểm tra nhanh về sự phân bố của BC. Ngoài ra cũng có thể quan sát sự phân bố của HC. HC chuỗi tiền hoặc HC ngưng tập cũng dễ dàng nhận thấy ở vật kính độ phóng đại thấp. Bên cạnh đó cũng có thể nhận diện nhanh những tế bào bất thường kích thước lớn như tế bào non, tế bào lympho phản ứng. Cuối cùng sau khi quan sát lam tổng thể là chọn vùng đọc lam thích hợp, vùng đọc lam là vùng HC xếp sát nhau hoặc chồng lên nhau ít.
Hình 2. Vùng đọc lam thích hợp (hồng cầu xếp sát nhau, hoặc chồng lên nhau ít và hình thái dạng dĩa lõm 2 mặt) và không thích hợp (hồng cầu thưa quá mất lõm sáng trung tâm, hoặc dày đặc)
· Dùng vật kính x40 để đánh giá hình thái các dòng tế bào máu (HC, TC, BC) và bách phân thành phần BC.
− Hồng cầu: Đánh giá về số lượng, màu sắc, kích thước, hình dạng hồng cầu
o Hình thái bình thường: HC là tế bào máu trưởng thành không nhân, hình dĩa lõm 2 mặt. Dưới kính hiển vi quang học, HC bình thường có đường kính 7-8 µm, hình tròn, với vùng trung tâm có màu sáng hơn (do dạng dĩa lõm 2 mặt) chiếm 1/3 tổng đường kính HC.
Hình 3. Hình thái HC, TC bình thường
o Đánh giá kích thước HC: HC to (macrocytic), bình thường (normocytic) hay HC nhỏ (microcytic)? Có thay đổi kích thước HC (anisocytosis)
o Đánh giá hình dạng HC: chú ý hình dạng HC bất thường đặc biệt: HC hình cầu (spherocyte), hình elip (elliptocyte hay ovalocyte), HC bia (target cell hoặc codocyte), HC hình miệng (stomatocyte), HC hình gai nhỏ (echinocyte hay burr cell), HC hình gai lớn (acanthocyte hay spur cell), HC hình giọt nước (tear drop cell hay dacryocyte), mảnh vỡ HC (schistocytes, keratocyte và burr cell), HC hình liềm (sickle cell).
o Đánh giá màu sắc HC: nhược sắc (hypochromia), hay ưu sắc (polychromasia), đẳng sắc (normochromatic).
o Đánh giá sự hiện diện HC nhân (NRBC).
− Tiểu cầu:
o Hình thái: TC là mảnh vỡ của mẫu tiểu cầu trong tủy xương phóng thích vào máu ngoại biên, tương tự HC, TC là tế bào máu trưởng thành không có nhân, hình thái bình thường dưới kính hiển vi quang học có kích thước 2-3 µm.
o Đánh giá số lượng, hình thái, kích thước và độ tập trung tiểu cầu.
§ Đánh giá số lượng tiểu cầu trên lam: tăng, giảm, bình thường theo bảng sau: (1 tiểu cầu quan sát được trên quang trường 100x tương đương khoảng 20.000 tiểu cầu/ mm3 máu)
§ Đánh giá kích thước: Tiểu cầu bình thường 2-3 µm, tiểu cầu kích thước lớn 3-7 µm, TC kích thước khổng lồ khoảng 10-20 µm.
Hình 4. Tiểu cầu khổng lồ
§ Đánh giá độ tập trung tiểu cầu chỉ đánh giá khi lame kéo trực tiếp và số lượng tiểu cầu > 100 k/uL. Kết quả sẽ được đánh giá theo số lượng đám tiểu cầu quan sát được trên lam kính. Giá trị của xét nghiệm như sau:
Độ tập trung tiểu cầu bình thường: 5 - 10 tiểu cầu/đám.
Độ tập trung tiểu cầu giảm: < 5 tiểu cầu/đám.
Độ tập trung tiểu cầu tăng : > 10 tiểu cầu/đám.
− Bạch cầu: Đánh giá về số lượng, hình thái và gõ công thức bạch cầu
Hình thái các loại bạch cầu bình thường trong máu ngoại vi:
o Neutrophil: kích thước khoảng 2 lần hồng cầu (đường kính khoảng 15 µm), tế bào chất chứa hạt mịn bắt màu tím-cam nhạt, nhân chia thùy (3-5 thùy), mỗi thùy được chia ra bởi sợi mảnh từ nguyên liệu của nhân, nhiễm sắc chất thô.
Hình 5. Neutrophil bình thường trong PMNB
o Eosinophil: kích thước hơi lớn hơn so với neutrophil, tế bào chất chứa hạt lớn màu đỏ cam, nhân chia thường 2 thùy, nhiễm sắc chất thô như neutrophil .
Hình 6. Eosinophil bình thường trong PMNB
o Basophil: kích thước nhỏ hơn so với neutrophil, đặc trưng sự hiện diện của hạt lớn, xanh đậm trong tế bào chất và che lấp nhân, nhân thường chia 2-3 thùy.
Hình 7. Basophil bình thường trong máu ngoại biên
o Tế bào Lympho kích thước nhỏ: hơi lớn hơn hồng cầu (đường kính khoảng 11 µm), hình tròn. Tế bào chất không chứa hạt, hẹp, màu xanh nhạt, nhân tròn, nhiễm sắc chất thô.
Hình 8. Tế bào lympho kích thước nhỏ
o Tế bào lympho kích thước lớn: hình tròn, kích thước gấp đôi hồng cầu (đường kính khoảng 15 µm), nhân lớn, tế bào chất rộng hơn, một số chứa hạt nguyên phát azurophilic, nhân và nhiễm sắc chất bắt màu tương tự lympho kích thước nhỏ.
Hình 9. Tế bào lympho kích thước lớn
o Tế bào mono: là tế bào bạch cầu bình thường lớn nhất (đường kính khoảng 20 µm). Thường nhiều hình dạng. Tế bào chất rộng, bắt màu xanh xám, có thể chứa hạt nguyên phát azurophilic đỏ- tím, mịn hơn so với tế bào lympho, một số có không bào. Nhân cuộn, đa hình dạng, một số có hình quả thận, xốp, nhiễm sắc chất mịn hơn.
Hình 10. Tế bào mono bình thường trong PMNB
− Đánh giá:
o Số lượng bạch cầu: công thức ước lượng số lượng bạch cầu trên lam
§ Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x40, chọn vùng hồng cầu xếp sát nhau hoặc chồng lên nhau ít, đếm tổng số lượng bạch cầu trên 10 quang trường 40x.
§ Tính số lượng bạch cầu trung bình trên 1 quang trường 40x.
§ (Số lượng bạch cầu trung bình trên 1 quang trường 40x) x 2.000, sẽ ước lượng được số lượng bạch cầu gần bằng với số lượng máy tự động tính bằng nghìn trên mỗi microliter.
o Hình thái, bách phân thành phần bạch cầu khi WBC > 1 k/uL (bách phân 100 bạch cầu đối với trường hợp không phải bệnh lí huyết học ác tính; bách phân 200 bạch cầu đối với trường hợp bạch cầu cấp, loạn sinh tủy); nếu WBC < 1 k/uL thì ghi nhận có tế bào bất thường không (blast, promyelocye bất thường, myelocyte, metamyelocye, promonocyte, plasma cell, hairy cell…).
Chọn vùng đọc lam (HC xếp sát nhau hoặc chồng lên nhau ít), tế bào bạch cầu sẽ được quan sát và phân loại bằng máy đếm (hình 14), theo hình zic-zac (hình 15)
Hình 11. Máy đếm bạch cầu
Hình 12. Bách phân thành phần bạch cầu theo hình zic-zac
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Clinician’s Guide to Laboratory Medicine, Samir P.Desai, MD
2. Rodak’s Hematology: Clinical Principles and applications, sixth edition.
3. L. Palmer, C.Briggs, S.Mcfadden et al. ICSH recommendations for the standardization of nomenclature and grading of peripheral blood cell morphological features.