I. XÉT NGHIỆM COOMBS TRỰC TIẾP:

      1. Coombs trực tiếp là gì?

      Vào năm 1908, nguyên lý sử dụng kháng globulin người (AHG: Anti human globulin) lần đầu tiên được mô tả bởi Moreschi. Đến năm 1945, ba nhà khoa học Coombs, Mourant và Race đã mô tả quá trình phát hiện các kháng thể gắn trên bề mặt hồng cầu bằng việc sử dụng AHG như một cầu nối trung gian. Từ đây, nghiệm pháp kháng globulin ra đời và được gọi theo tên nhà khoa học Coombs là nghiệm pháp Coombs. Nghiệm pháp này đã được phát triển hoàn thiện và ứng dụng rộng rãi đến ngày nay để phát hiện các kháng thể không mong muốn trong máu.

      Nghiệm pháp Coombs trực tiếp (DAT: direct antiglobulin test) là kỹ thuật xét nghiệm sử dụng AHG làm cầu nói trung gian kết nối các kháng thể bất thường hay bổ thể bám trên bề mặt nhiều tế bào hồng cầu tạo nên cụm ngưng kết có thể quan sát được. Các cụm ngưng kết hình thành được đánh giá ở 5 mức độ khác nhau: âm tính và dương tính 1+,2+,3+,4+ tương ứng với các mức độ số lượng kháng thể có mặt trong máu.

 

Hình 1. Nguyên lý tác dụng của kháng globulin người (AHG)

      2. Sự xuất hiện các kháng thể bất thường và bổ thể

      Kháng thể miễn dịch được các tế bào lympho B sinh ra sau khi cơ thể tiếp xúc với các kháng nguyên "lạ", tuỳ theo loại kháng nguyên tiếp xúc mà kháng thể hình thành có các tên gọi khác nhau trong đó 2 loại kháng thể được quan tâm nhất trong miễn dịch truyền máu là kháng thể miễn dịch đồng loại và tự kháng thể.

      + Kháng thể miễn dịch đồng loại (alloantibody) là kháng thể được hình thành sau sự tiếp xúc với các kháng nguyên “lạ” không tồn tại trên hồng cầu người bệnh. Sự tiếp xúc này thường xảy ra trong thai kì, sau quá trình truyền máu hay sau cấy ghép tế bào gốc. Về mặt lâm sàng, kháng thể đồng loại chỉ tồn tại trong huyết thanh mà không trực tiếp chống lại kháng nguyên trên hồng cầu người bệnh, tuy nhiên nếu không được phát hiện và lưu ý thì các kháng thể này có thể gây tán huyết ở những lần truyền máu tiếp theo do chống lại hồng cầu của túi máu có các kháng nguyên tương ứng. Ngoài ra khi quá trình sinh miễn dịch xảy ra trong thai kì, các kháng thể đồng loại dạng IgG ở cơ thể người mẹ có thể qua được màng nhau thai và chống lại kháng nguyên tương ứng trên hồng cầu của thai nhi gây nên tình trạng tán huyết rất nguy hiểm cho thai nhi.

      + Tự kháng thể (autoantibody) là các kháng thể bất thường sinh ra do sự rối loạn miễn dịch bên trong cơ thể và chống lại chính kháng nguyên của cơ thể sinh ra nó. Loại kháng thể này có khả năng gắn trực tiếp lên bề mặt hồng cầu và có thể gây nên tình trạng tán huyết nguy hiểm cho người bệnh.

      Bổ thể là một chuỗi protein huyết tương chủ yếu là dạng enzyme, gồm 9 thành phần ký hiệu C1 đến C9. Các kháng thể gắn trên bề mặt hồng cầu có thể hoạt hóa hệ thống bổ thể bám thêm vào màng hồng cầu gây phá hủy trực tiếp tế bào hồng cầu hoặc làm tăng hiện tượng thực bào, ẩm bào tại hệ liên võng nội mô.

      Sự tồn tại của các loại kháng thể bất thường và bổ thể trên bề mặt hồng cầu có thể gây nên tình trạng tán huyết miễn dịch trên lâm sàng do đó mà việc xác định sự có mặt của các kháng thể và bổ thể trên bề mặt hồng cầu bằng xét nghiệm Coombs trực tiếp góp phần quan trọng giúp các bác sĩ đưa ra chẩn đoán và hướng điều trị phù hợp.

      3. Bệnh viện Truyền máu Huyết học thực hiện xét nghiệm Coombs trực tiếp như thế nào?

      Tại bệnh viện Truyền máu Huyết học, xét nghiệm Coombs trực tiếp được thực hiện và kiểm tra chéo trên 3 hệ thống xét nghiệm bao gồm kỹ thuật Coombs trực tiếp trên ống nghiệm, kỹ thuật Coombs trực tiếp bằng phương pháp gel trên hệ thống máy bán tự động Matrix và hệ thống máy tự động Daymate-S. Cả ba kỹ thuật trên đều đã được kiểm định đạt các tiêu chẩn chất lượng xét nghiệm ISO 15189 và ISO 9001 do đó luôn đảm bảo cung cấp kết quả xét nghiệm với độ tin cậy cao hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh lý huyết học.

Hình 2. Các hệ thống xét nghiệm Coombs trực tiếp tại bệnh viện Truyền máu Huyết học. (1) Kỹ thuật Coombs trực tiếp trên ống nghiệm, (2) Hệ thống máy bán tự động Matrix, (3) Hệ thống máy tự động Daymate-S

      Quy cách lấy mẫu và bảo quản mẫu:

      + Chuẩn bị mẫu: lấy 2mL mẫu máu tĩnh mạch máu vào ống chống đông EDTA hoặc Citrate. Mẫu máu đảm bảo không bị đông, bị đục hay tán huyết. Mẫu máu nên được quay ly tâm ở 1500 vòng trong 10 phút trước khi thực hiện xét nghiệm để loại bỏ các sợ fibrin có thể gây nhiễu kết quả.

      + Điều kiện bảo quản mẫu: xét nghiệm nên được thực hiện sớm ngay sau khi lấy mẫu. Trong điều kiện không thể thực hiện xét nghiệm ngay mẫu máu cần được bảo quản ở 2-8oC và tốt nhất nên xét nghiệm trong vòng 48 giờ kể từ khi lấy mẫu.

      II. MỘT SỐ TRƯỜNG HỢP DAT DƯƠNG TÍNH:

      Sự kết cụm của các tế bào hồng cầu trong quá trình xét nghiệm cho thấy một kết quả bất thường. Ngưng kết (kết cụm) của các tế bào máu của bạn trong một xét nghiệm Coombs trực tiếp có nghĩa là có kháng thể bám trên các tế bào hồng cầu và có thể có một tình trạng gây ra sự phá hủy các tế bào hồng cầu bởi hệ thống miễn dịch, được gọi là tán huyết.

      Các tình trạng có thể khiến có kháng thể trên các tế bào hồng cầu là:

      · Thiếu máu tán huyết tự miễn dịch, khi hệ thống miễn dịch phản ứng với các tế bào hồng cầu

      · Phản ứng truyền máu, khi hệ thống miễn dịch tấn công máu người hiến tặng

      · Tăng hồng cầu thai (erythroblastosis fetalis), hoặc các bất đồng nhóm máu giữa mẹ và trẻ sơ sinh

      · Bệnh bạch cầu lympho mãn tính và một số bệnh bạch cầu khác

      · Lupus ban đỏ hệ thống, một bệnh tự miễn dịch và là loại lupus phổ biến nhất

      · Bệnh bạch cầu đơn nhân

      · Nhiễm mycoplasma, một loại vi khuẩn mà nhiều loại kháng sinh không thể tiêu diệt

      · Giang mai

      Độc tính thuốc là một tình trạng khác có thể khiến xuất hiện kháng thể trên các tế bào hồng cầu. Các loại thuốc có thể dẫn đến điều này bao gồm:

 

      Hình 3. Các thuốc liên quan đến thiếu máu tán huyết tự miễn và/hoặc xét nghiệm DAT dương tính.

      III. XÉT NGHIỆM DAT TRÊN BỆNH LÝ THALASSEMIA

      1. Khái niệm về Thalassemia

      Alpha và beta thalassemia là các bệnh lý hemoglobin di truyền, làm giảm sản xuất của một loại chuỗi globin (chuỗi alpha trong alpha thalassemia; chuỗi beta trong beta thalassemia) gây ra sự mất cân bằng tỷ lệ giữa chuỗi alpha và beta (hoặc giống beta), thường được kiểm soát chặt chẽ. Tổng hợp cân bằng rất quan trọng vì các tetramer hemoglobin A (HbA) và hemoglobin F (HbF) còn nguyên vẹn có độ hòa tan cao trong tế bào chất hồng cầu, nhưng chuỗi alpha và beta không nguyên vẹn thì không. Chúng kết tủa, gây tổn thương tế bào đáng kể. Do đó, những chuỗi đơn lẻ này gây ra vấn đề với sự trưởng thành của hồng cầu và dẫn đến tạo máu không hiệu quả, thiếu máu tán huyết, quá tải sắt và các biến chứng tiếp theo.

      2. Tán huyết trong Thalassemia

      Cả alpha và beta thalassemia đặc trưng bởi tán huyết ở máu ngoại biên dẫn đến giảm đến 1/3 đời sống hồng cầu bình thường (ví dụ giảm từ 28 đến 37 ngày còn 12 đến 19 ngày) và gây thiếu máu.

      Cơ chế có liên quan đến tổn thương màng do sự tập hợp, kết tủa, và/hoặc chuỗi globin oxy hoá, có thể gây tổn thương màng hồng cầu, cũng như gây ra những biến đổi ở các đặc điểm cơ học như của hồng cầu (độ bền, sự khử nước, giảm tính biến dạng) làm chậm con đường di chuyển qua các xoang của hệ lưới nội mô và tăng sự thực bào bởi đại thực bào của lưới nội mô. Sự di chuyển chậm qua các vi mạch cho phép đại thực bào của các cơ quan lưới nội mô cẩn thận phân tích các hồng cầu này và phát hiện ra bất kì các tín hiệu bề mặt tế bào, báo hiệu cho đại thực bào đến cô lập, gắn kết và thực bào các hồng cầu mục tiêu.

      Các tín hiệu cho thực bào đã được nghiên cứu rộng rãi và có thể bao gồm những yếu tố sau đây:

      + Giảm axit sialic trong màng.

      + Biểu hiện ra ngoài của phosphatidylserine (PS), trong các RBC bình thường được giới hạn trong màng bên trong và cô lập khỏi các đại thực bào. Như đã lưu ý ở trên, trong một số RBC beta thalassemia, lớp màng bị gián đoạn (có lẽ do tổn thương oxy hóa) và PS được bộc lộ trên màng ngoài.

     + Tự kháng thể chống RBC có thể hình thành khi các protein màng bất thường được phơi bày. Tổn thương oxy hóa từ heme, hemichromes và/hoặc sắt liên quan đến màng có thể khiến protein màng tổng hợp bất thường và tạo ra các kháng nguyên mới. Như đã lưu ý ở trên, sự gia tăng IgG màng và các thành phần bổ thể có khả năng đóng góp cho sự gia tăng thực bào của RBC alpha thalassemia. Đại thực bào có thể xác định các miền Fc của IgG trên bề mặt màng ngoài của RBC.

      + Tăng sản xuất cytokine, đặc biệt là yếu tố hoại tử khối u, có thể kích hoạt monocytes và đại thực bào và làm cho chúng thực bào nhiều hơn. Nồng độ huyết thanh của yếu tố kích thích đại thực bào/monocyte (M-CSF) tăng cao trong bệnh HbH và tương quan nghịch với nồng độ hemoglobin của bệnh nhân.

      Tầm quan trọng của việc làm sạch lưới nội mô của các tế bào bất thường này được minh họa bằng quan sát rằng những người bị beta thalassemia đã trải qua phẫu thuật cắt lách (và do đó thiếu cơ chế làm sạch này) có tỷ lệ RBC với màng không ổn định và bất thường hơn. Những người bị alpha thalassemia đã trải qua phẫu thuật cắt lách có sự gia tăng nồng độ IgG bề mặt RBC màng.

      Trong các dị hợp tử hợp chất của bệnh HbH và Hb Constant Spring (HbH/CS), sự phá hủy RBC ngoại vi được tăng lên, với thời gian bán huỷ chỉ 8,3 ngày (so với thời gian bán huỷ bình thường là 26 ngày sử dụng cùng một xét nghiệm). Trong dạng đồng hợp (HbCS/CS), có kiểu hình của một đặc điểm alpha thalassemia, thời gian bán huỷ là 13,7 ngày. RBC HbH/CS có nhiều IgG liên quan đến màng hơn so với RBC bình thường hoặc HbH.

      3. Xét nghiệm DAT trên bệnh nhân Thalassemia

      Nghiên cứu của S.A. Arinsburg và cộng sự cho thấy DAT được thực hiện để phát hiện kháng thể hoặc bổ thể trên bề mặt của RBC. Đơn vị của nhóm nghiên cứu trước đây đã thực hiện DAT trên tất cả các bệnh nhân thalassemia truyền máu mãn tính trước mỗi đợt truyền máu để phát hiện dị miễn dịch sớm.

Nhóm nghiên cứu khảo sát tất cả các bệnh nhân thalassemia được điều trị tại cơ sở từ năm 2004 đến năm 2007 để xác định tầm quan trọng của tỷ lệ DAT dương tính cao (52,5% trong số 80 bệnh nhân). Kết quả cho thấy phần lớn các DAT phản ứng IgG có liên quan đến dạng không hoạt động. DAT dương tính có liên quan đáng kể đến phẫu thuật cắt lách (p < 0,001), nồng độ IgG tăng cao (p < 0,001), HCV (p < 0,001) và tự kháng thể nóng (p = 0,03).

      Phân tích đa biến cho thấy chỉ có HCV (OR, 5,0; p = 0,037) và nồng độ IgG tăng cao (OR, 9,0; p = 0,001) có liên quan độc lập với DAT dương tính. Bệnh nhân thalassemia có dị miễn dịch có nhiều khả năng có DAT dương tính hơn bệnh nhân không có, nhưng sự liên quan này không đáng kể (OR, 2,2; p = 0,11).

DAT dương tính không tương quan với giảm đáp ứng với truyền máu, tỷ lệ sống sót của RBC, tán huyết hoặc tăng nhu cầu truyền máu. Chỉ có 2 trường hợp dị miễn dịch sớm được DAT phát hiện trong số 288 mẫu DAT dương tính được nghiên cứu trong 4 năm.

      4. Mối liên hệ giữa DAT dương tính và AIHA trên bệnh nhân Thalassemia

Nghiên cứu của Monia Ben Khaled và cộng sự, ở bệnh nhân beta-thalassemia, tự kháng thể hồng cầu có thể yên lặng hoặc dẫn đến thiếu máu tán huyết tự miễn dịch (AIHA). Mục đích của nhóm nghiên cứu này là xác định các yếu tố dự đoán AIHA ở bệnh nhân beta-thalassemia với xét nghiệm antiglobulin trực tiếp dương tính (DAT), ở Tunisia.

      Nghiên cứu tiên lượng theo chiều dọc này được thực hiện trên bệnh nhân beta-thalassemia với DAT được xác nhận dương tính. Các yếu tố dự đoán của AIHA đã được xác định bằng phương pháp Kaplan-Meier. Một phân tích mô hình Cox đã được sử dụng để xác định các yếu tố dự báo độc lập.

      Trong số 385 bệnh nhân beta thalassemia, 87 người có DAT dương tính (22,6%). Thiếu máu tán huyết tự miễn dịch đã xảy ra ở 25 bệnh nhân. Các phân tích đa biến cho thấy AIHA có liên quan độc lập với beta-thalassemia thể vừa và tiền sử gia đình AIHA. Cắt lách ở bệnh nhân DAT dương tính có liên quan độc lập với tăng nguy cơ AIHA (HR = 6.175, CI: 2.049–18.612, p<0,001). Nguy cơ AIHA cao hơn trong 72 lần truyền máu đầu tiên. Thiếu máu tán huyết tự miễn dịch có liên quan đáng kể đến DAT đa đặc hiệu (chống bổ thể và chống IgG), nhóm máu AB và dị miễn dịch trước đó. Trong khi truyền máu phenotype và lọc bạch cầu là một yếu tố bảo vệ.

      Tóm lại, cắt lách sau khi tự miễn dịch, dị miễn dịch trước đó, DAT đặc hiệu (IgG với bổ thể), thalassemia thể vừa, nhóm máu AB và tiền sử gia đình AIHA có liên quan chặt chẽ với AIHA. Truyền máu lọc bạch cầu đã được chứng minh có vai trò phòng ngừa.

      Nghiên cứu của Anchalee Thedsawad và cộng sự khảo sát tần suất tự kháng thể và dị kháng thể RBC, sử dụng Coombs trực tiếp và tế bào dòng chảy để phát hiện sự hiện diện tự kháng thể RBC, đồng thời xác định dị kháng thể bằng sàng lọc và định danh kháng thể bất thường. Nghiên cứu xác định tỷ lệ phổ biến và ý nghĩa lâm sàng của IgG liên kết tế bào hồng cầu (RBC) được phát hiện bởi tế bào học dòng chảy ở bệnh nhân thalassemia được truyền máu nhiều lần. Mối quan hệ về sự hiện diện của IgG gắn liền với RBC với dị miễn dịch RBC cũng được đánh giá. Nghiên cứu này bao gồm 59 bệnh nhân bệnh β-thalassemia được truyền máu nhiều lần. Các tác giả đã nghiên cứu tần số của các tự kháng thể RBC và dị miễn dịch. Xét nghiệm Coombs trực tiếp và tế bào học dòng chảy đã được thực hiện để phát hiện sự hiện diện của các tự kháng thể RBC trong khi các dị kháng thể RBC được phát hiện bằng sàng lọc kháng thể và định danh.

      + 8 (13,6%) và 34 (57,6%) bệnh nhân có xét nghiệm Coombs trực tiếp dương tính và tế bào học dòng chảy dương tính. 20 (33,9%) bệnh nhân đã phát triển dị kháng thể RBC. 4 kháng thể RBC thường gặp nhất lần lượt là anti-E (55%), anti-Mia (40%), anti-Di(a) (25%) và anti-c (15%).

Không có sự khác biệt đáng kể về sự hiện diện của IgG liên kết RBC giữa bệnh nhân thalassemia truyền máu nhiều lần đã có dị miễn dịch RBC (13 trong số 20; 65%) và những người không có kháng thể RBC (21 trong số 39; 53,8%), p = 0,412.

      Cắt lách và tăng yêu cầu truyền máu có liên quan đáng kể đến sự hiện diện của IgG gắn liền với RBC nhưng không phải với sự hình thành dị kháng thể RBC.

      Tần suất tổng thể của sự hình thành dị kháng thể RBC ở bệnh nhân thalassemia truyền máu nhiều lần là 33,9%. Dị kháng thể RBC phổ biến nhất là anti-E. Sự hình thành tự kháng thể RBC được phát hiện thường xuyên hơn bằng phép đo tế bào học dòng chảy (57,6%) so với xét nghiệm Coombs trực tiếp (13,6%). Cắt lách có liên quan đáng kể đến sự phát triển của các tự kháng thể IgG liên kết RBC tự động ở những bệnh nhân thalassemia truyền máu nhiều lần. Sự hiện diện của các tự kháng thể chống RBC có thể gây ra sự gia tăng nhu cầu truyền máu.

      Tóm lại, người bệnh Thalassemia có tần suất cao xuất hiện DAT dương tính do nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó chủ yếu là do các bất thường trên màng hồng cầu. Kết quả các nghiên cứu cho thấy DAT dương tính có liên quan đáng kể đến phẫu thuật cắt lách, nồng độ IgG tăng cao, nhiễm HCV và tự kháng thể nóng. Tuy nhiên, các nghiên cứu cho thấy việc DAT dương tính trên nhóm bệnh này không liên quan đến việc giảm hiệu quả truyền máu, tỷ lệ sống sót của RBC, tán huyết hoặc tăng nhu cầu truyền máu. Đồng thời, để xác định các yếu tố dự đoán AIHA ở bệnh nhân beta-thalassemia với xét nghiệm antiglobulin trực tiếp dương tính (DAT), các nghiên cứu cho thấy AIHA có liên quan độc lập với beta-thalassemia thể vừa và tiền sử gia đình AIHA và cắt lách. Ngoài ra, AIHA có liên quan đáng kể đến DAT đa đặc hiệu (chống bổ thể và chống IgG), nhóm máu AB và dị miễn dịch trước đó. Truyền máu phenotype và lọc bạch cầu là một yếu tố giúp hạn chế AIHA.

Mọi chi tiết xin vui lòng liên hệ:

Khoa Miễn dịch (lầu M) - Bệnh viện Truyền máu Huyết học;

Số 01 Trần Hữu Nghiệp, xã Tân Kiên, huyện Bình Chánh, TP. Hồ Chí Minh

ĐT: 028 3925 6822 (số nội bộ 124)

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. AABB Standards for Blood Banks and Transfusion Services. 25th Edition. Bethesda: America Association of Blood Banks; 2009. p. 16.

2. Coombs RR, Mourant AE, Race RR (1945). A new test for the detection of weak and ‘incomplete’ Rh agglutinins, Br J Exp Pathol, 26: 255-266.

3.http://www.tulipgroup.com/Tulip_New/html/pack_inserts/matrix/MATRIX_DIRECT_ANTIGLOBULIN_TEST.pdf

4. https://www.healthline.com/health/coombs-test#risks

5.https://www.uptodate.com/contents/pathophysiology-of-thalassemia?search=thalassemia%20diagnosis&source=search_result&selectedTitle=2~150&usage_type=default&display_rank=2

6.Arinsburg, Suzanne & Skerrett, Donna & Kleinert, Dorothy & Giardina, Patricia & Cushing, Melissa. (2010). The significance of a positive DAT in thalassemia patients. Immunohematology / American Red Cross. 26. 87-91. 10.21307/immunohematology-2019-207.

7. Monia Ben Khaled, Monia Ouederni, Nessrine Sahli, Nawel Dhouib, Ahmed Ben Abdelaziz, Samia Rekaya, Ridha Kouki, Houda Kaabi, Hmida Slama, Fethi Mellouli, Mohamed Bejaoui, Predictors of autoimmune hemolytic anemia in beta-thalassemia patients with underlying red blood cells autoantibodies, Blood Cells, Molecules, and Diseases, Volume 79, 2019,102342, ISSN 1079-9796, https://doi.org/10.1016/j.bcmd.2019.102342.

BS.CKII.Lâm Trần Hoà Chương, BS.CKI.Nguyễn Ngọc Sang, CN.Trần Hồng Trúc