Ở Việt Nam, theo quy định của thông tư 26/2013/TT-BYT ngày 16/9/2013 của Bộ Y tế về Hướng dẫn hoạt động truyền máu quy định việc đảm bảo an toàn truyền máu phải được thực hiện đồng bộ hiệu quả từ công tác tuyên truyền, vận động hiến máu, tuyển chọn người hiến máu, lấy mẫu, điều chế, bảo quản, vận chuyển, quản lý, sử dụng máu và chế phẩm máu. Trong đó, việc đảm bảo tất cả các đơn vị máu được sàng lọc an toàn các bệnh lây qua đường truyền máu như HBsAg, Anti-HCV, HIV và giang mai bằng kỹ thuật huyết thanh học và HBV-DNA, HCV-RNA, HIV-RNA bằng kỹ thuật sinh học phân tử NAT (Nucleic acid test) là quy định bắt buộc. Dưới đây là 2 phương pháp được Bệnh viện Truyền máu Huyết học sử dụng để sàng lọc các tác nhân lây nhiễm qua đường truyền máu cho người hiến máu

      Phương pháp miễn dịch huyết thanh học:

      Đây là phương pháp giúp phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể đặc hiệu, cho đến nay phương pháp này là công cụ chẩn đoán chủ yếu để xác định các virus gây bệnh ở người. Các phương pháp xét nghiệm được triển khai tại Bệnh viện:

- Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay còn gọi là phương pháp EIA

- Phương pháp điện hóa phát quang (ECLIA)

- Phương pháp hóa phát quang (CMIA)

      Các phương pháp này được sử dụng phổ biến trong sàng lọc máu ở tất cả các nước trên thế giới. Kỹ thuật có độ chính xác cao, thuận tiện và tự động hoàn toàn. Tuy nhiên, do nguyên tắc phát hiện dựa trên kháng nguyên kháng thể nên đối với những bệnh nhân chưa xuất hiện kháng nguyên, kháng thể, hoặc kháng nguyên, kháng thể đã mất đi thì phương pháp này không phát hiện được. Do đó cần có một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nữa để phát hiện sớm virus gây bệnh.

      Phương pháp sinh học phân tử (Kỹ thuật NAT)

      Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (NAT) là một trong những kỹ thuật tiên tiến nhất hiện nay mà Bộ Y tế đã ban hành Thông tư cho phép áp dụng trong sàng lọc máu. Kỹ thuật này giúp phát hiện trực tiếp các DNA hoặc RNA của virus, rút ngắn thời gian cửa sổ trong việc phát hiện các virus lây nhiễm có trong mẫu máu thu thập và cho kết quả phân tích chính xác, tin cậy.

      Các kỹ thuật NAT áp dụng trong sàng lọc HBV, HCV, HIV được phát triển trên thế giới phổ biến nhất là TMA (Transcription mediated amplification) và PCR (polymerase chain reaction). Hai kỹ thuật này đều được sử dụng tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học để sàng lọc túi máu

      Kỹ thuật TMA: là phương pháp khuếch đại acid nucleic dựa vào phiên mã sử dụng hai enzyme RNA polymerase và reverse transcriptase. Enzyme reverse transcriptase tạo phiên bản chuỗi đôi DNA từ 1 RNA hay DNA đích. Tiếp đó, enzyme RNA polymerase tạo hàng ngàn phiên bản RNA bổ sung (RNA amplicon) từ chuỗi đôi DNA. Mỗi RNA amplicon sẽ trở thành đích mới cho chu kỳ hoạt động tiếp theo của reverse transcriptase và RNA polymerase. Kết quả của sự khuếch đại theo cấp số nhân của quy trình là từ một acid nucleic đích ban đầu sẽ cho hơn một triệu bản sao. Các amplicon từ tiến trình này sẽ được phát hiện nhờ quá trình lai với đoạn dò đặc hiệu có gắn chất nhuộm phát quang.

 

Nguyên lý kỹ thuật TMA

      Kỹ thuật Realtime PCR (Real time PCR): là kỹ thuật khuếch đại chuỗi acid nucleic trong đó sản phẩm của phản ứng PCR được theo dõi qua mỗi chu kỳ nhờ đoạn dò đặc hiệu hay chất gắn DNA có phát huỳnh quang. Trong số các đoạn dò cho Realtime-PCR, đoạn dò Taqman là đoạn dò được sử dụng phổ biến nhất vì đặc hiệu và dễ thiết kế. Đoạn dò Taqman là những oligonucleotide kích thước khoảng 24-30 cặp base, có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích. Đoạn dò Taqman có đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) và đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher). Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm thì đoạn dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn nên huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ, do đó không có tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng. Khi phản ứng PCR diễn ra, đoạn dò Taqman sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm và sẽ bị Taq polymerase có mặt trong phản ứng PCR cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung. Lúc này đầu reporter bị cắt ra, rời xa đầu quencher nên reporter không còn bị ảnh hưởng của quencher và do đó reporter sẽ phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Sản phẩm của phản ứng PCR được đánh giá sau mỗi chu kỳ nhờ sự phát huỳnh quang.

 

      Nguyên lý kỹ thuật Realtime PCR

      Đa số xét nghiệm NAT trong sàng lọc HBV, HCV và HIV sử dụng phản ứng đa mồi để trong cùng 1 phản ứng có thể phát hiện đồng thời việc nhiễm HBV, HCV và HIV. Việc áp dụng kỹ thuật NAT kết hợp cùng với kỹ thuật miễn dịch huyết thanh học giúp rút ngắn giai đoạn cửa sổ cho ra kết quả chính xác, nhanh hơn, tránh các trường hợp âm tính giả, góp phần bảo đảm an toàn truyền máu phòng lây nhiễm HIV, HCV, HBV cho người bệnh được truyền máu.

ThS. Nguyễn Thanh Sơn